體外培養(yǎng)細(xì)胞除可直接觀察活細(xì)胞外，還可以用固定細(xì)胞的方法將細(xì)胞制成永久標(biāo)本進(jìn)行觀察。固定染色觀察，既可顯示細(xì)胞形態(tài)，也可揭示細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的觀察技術(shù)。其基本技術(shù)為固定染色和觀察。
一、細(xì)胞固定基本方法
無(wú)論用雙蓋片懸浮培養(yǎng)、加蓋片單層培養(yǎng)還是懸液培養(yǎng)，都能將細(xì)胞固定染色，其中以蓋片培養(yǎng)最常用。其步驟為：
（1）培養(yǎng)時(shí)加入一清潔蓋片。
（2）待蓋片長(zhǎng)滿細(xì)胞或所需的適宜時(shí)期用鑷子輕輕取出蓋片，迅速投入37℃Hanks液中漂洗兩次，每次3～5秒鐘，以洗除血清防止其妨礙染色；如用懸液培養(yǎng)的細(xì)胞時(shí)，需離心(800rpm)，除去含血清的培養(yǎng)液，再向沉降細(xì)胞中加入少許溫Hanks液，用吸管輕輕吹打漂洗后，留少許懸液，再做涂片，涼干后固定。
（3）固定 將上述玻片浸于固定液15分鐘。常用的固定劑有甲醇/醋酸、FAA固定液、Carnoy。甲醇/醋酸濃度為甲醇3分，冰醋酸1分，現(xiàn)用現(xiàn)配，適用于觀察染色體和Giemsa染色。FAA固定液濃度為：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福爾馬林(40%甲醛，用時(shí)向瓶中加過(guò)量MgCO3中和)5.0mL。適用于蓋片單層培養(yǎng)，固定效果好。Carnoy是較好的非水溶性固定液，濃度為純酒精60.0mL，氯仿30.0mL，冰醋酸10.0mL，適用于顯示細(xì)胞化學(xué)成分等方法，如粘多糖等，對(duì)固定培養(yǎng)單層細(xì)胞效果很好。但穿透力差。
二、常用染色方法
1、H．E(蘇木精一伊紅)染色法
H．E染色法是細(xì)胞化學(xué)染色方法中最常用的一種方法。其基本原理是用堿性染料蘇木精和酸性染料伊紅分別與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生作用，使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)通過(guò)顏色而改變它的折射率，從而在光鏡下能清晰地呈現(xiàn)出細(xì)胞圖像，并能提供良好的核漿對(duì)比染色。
染色的基本材料為：
蘇木精染液
蘇木精 0.5g
溶于70mL蒸餾水中
銨礬(NH4)2SO4AL2(SO4)3 24.0g
H2O 5.0mL 再加入甘油30mL和冰醋酸2mL混合均勻，
NaIO3 0.1g 濾紙過(guò)濾備用。
伊紅 0.5g 溶于100.0mL蒸餾水中。
染色過(guò)程為：樣品制備、染細(xì)胞核、染細(xì)胞質(zhì)、脫水、透明和封固等。注意貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用蓋玻片培養(yǎng)法制備樣品；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞用離心甩片機(jī)制備樣品。
染色的步驟(蓋片培養(yǎng)法為例)：
（1）用鑷子輕輕取出已在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間，細(xì)胞基本長(zhǎng)成單層的蓋玻片，用37℃溫PBS漂洗3次，每次20秒～1分鐘；
（2）將蓋玻片浸入中性福爾馬林30分鐘；
（3）PBS洗2次，每次1分鐘，蒸餾水漂洗1次，浸入用蒸餾水稀釋的蘇木精液(1/20)染色10分鐘；
（4）自來(lái)水浸洗，置入1%NaHCO3液中洗至藍(lán)紫色；
（5）伊紅水溶液中染30秒～1分鐘；
（6）蒸餾水洗，迅速通過(guò)丙酮2次，每次3～5分鐘；
（7）通過(guò)2:1丙酮/二甲苯3次，每次1～2分鐘；
（8）通過(guò)1:2丙酮/二甲苯3次，每次1～2分鐘；
（9）通過(guò)純二甲苯5～10分鐘；
（10）把蓋片細(xì)胞面向上，置載物玻片上，用樹(shù)膠封存，再覆以較大蓋片。
也可以用95%酒精作為固定液，用稀鹽酸酒精溶液(75%酒精配制1%鹽酸)作為分色液，用淡氨水溶液(在400mL自來(lái)水中滴2滴濃氨水)使胞核藍(lán)化。其染色的基本步驟為：
①將有細(xì)胞的蓋玻片用溫PBS洗3次后，浸入95%酒精固定15分鐘。
②PBS洗2次，每次1分鐘，然后浸入蘇木精染液，染色5～10分鐘。
③自來(lái)水浸洗后，浸入稀鹽酸酒精溶液，數(shù)秒鐘，進(jìn)行分色。
④自來(lái)水浸洗后浸入淡氨水中3～5分鐘，使胞核藍(lán)化。
⑤自來(lái)水浸洗后浸入伊紅染液，染色5～10分鐘。
⑥自來(lái)水浸洗，經(jīng)70%、80%、90%酒精各1次，95%酒精2次和100%酒精3次逐級(jí)脫水，每次1分鐘。
⑦通過(guò)二甲苯3次，每次1分鐘。
⑧在載玻片上滴加中性樹(shù)膠，將有細(xì)胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。
光鏡下觀察，細(xì)胞呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。
2、Giemsa染色法
Giemsa染色也是最常用的染色方法之一，適用于多種細(xì)胞和染色體染色。其主要用Giemsa染液可將細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿染成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞及染色體圖像。
Giemsa染色的基本材料為：
Giemsa粉0.5g，甘油22mL，將Giemsa粉置于研缽內(nèi)先用少量甘油與之充分混合，研磨至無(wú)顆粒；然后將剩余的甘油混在一起，56℃保溫2小時(shí)后，加入33mL純甲醇，保存于棕色瓶?jī)?nèi)。
染色的基本步驟為：
（1）準(zhǔn)備染液：用pH6.81～7.38的Sorensen緩沖液，按1:9比例取Giemsa染液和Sorensen緩沖液混合配成染色液；
Sorensen緩沖液的配制：
pH6.81：Na2HPO4(1/15M) 50mL + KH2PO4(1/15M) 50mL;
pH6.98：Na2HPO4(1/15M) 60mL + KH2PO4(1/15M) 40mL
pH7.17：Na2HPO4(1/15M) 70mL+ KH2PO4(1/15M) 30mL；
pH7.38：Na2HPO4(1/15M) 80mL + KH2PO4(1/15M) 20mL。
(2)細(xì)胞標(biāo)本用甲醇固定10分鐘，或用1:3醋酸/甲醇固定30分鐘，用滴管把染色液布滿玻片上，注意不要有氣泡，用染色缸染色亦可，染10～15分鐘；
(3)用自來(lái)水沖去玻片上多余的染料，自然干燥，二甲苯透明，光學(xué)樹(shù)脂膠封固。
染色液宜現(xiàn)用現(xiàn)配，保存時(shí)間不超過(guò)48小時(shí)。緩沖液pH值要準(zhǔn)確，否則影響染色效果。用染色缸染色前應(yīng)先用小片濾紙刮除液面的氧化后，再進(jìn)行染色。染色完畢將標(biāo)本浸入水中洗除染液。
Giemsa染色光鏡下觀察細(xì)胞核呈紫紅色或藍(lán)紫色，細(xì)胞漿成粉紅色。
三、特殊染色方法
隨著組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞染色方法也有了較大的發(fā)展。為了能夠鑒別細(xì)胞中的DNA，Feulgen于1924年提出了Feulgen染色法。有些科學(xué)家把血清學(xué)方法和顯微示蹤方法結(jié)合起來(lái)又形成了免疫細(xì)胞化學(xué)染色法，如免疫熒光染色法和免疫酶染色法，這些為進(jìn)一步分辨細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)提供了更為先進(jìn)的手段和技術(shù)。
(一)Feulgen染色法
此法的基本原理是細(xì)胞中的DNA在60℃用1N HCl酸解離脫氧核糖核酸，使嘌呤堿基與糖苷鍵破壞，嘌呤堿脫掉，脫氧核糖中的醛基游離，醛基能與Schiff試劑相結(jié)合，形成一種紫色的復(fù)合物。
1、Feulgen染色的基本材料：
(1)1N HCl：用濃HCl 8.5mL+蒸餾水91.5mL稀釋。
(2)Schiff氏劑：將堿性品紅0.5g加入到100mL煮沸的蒸餾水中，再煮3～5分鐘，冷卻，過(guò)濾；冷卻至25℃時(shí)，再加入1NHCl 10mL，偏重亞硫酸鈉1.5g，裝入棕色瓶中，蓋緊，黑紙包裹存于暗處；漂洗液用10%亞硫酸鈉溶液10.0mL加蒸餾水200.0mL，1N HCl 10.0mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、Feulgen染色的基本步驟：
(1)將細(xì)胞置入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)一段時(shí)間，將長(zhǎng)成單層的蓋玻片取出，用Carnoy或醋酸/甲醇固定20～30分鐘。
(2)室溫下置入1N HCl 1～2分鐘。
(3)再投入60℃ 1N HCl 8～10分鐘。
(4)在10℃暗處投入Schiff劑中染色1～5分鐘。
(5)取出在漂洗液中漂洗2次，每次2分鐘。
(6)在蒸餾水中漂洗2次，每次2分鐘。
(7)用75%→100%的酒精依次脫水，每次1分鐘。
(8)用二甲苯透明2次，每次3分鐘。
(9)用樹(shù)膠封片，封實(shí)后蓋片上加微型重物加壓，置數(shù)日，樹(shù)膠干后觀察。
本方法中酸的離解是關(guān)鍵，溫度過(guò)低或酸度不夠，醛基暴露不充分，染色會(huì)過(guò)淺；反之，酸解過(guò)分，導(dǎo)致DNA完全解聚，染色反應(yīng)會(huì)減弱。細(xì)胞中RNA對(duì)酸比較穩(wěn)定，醛基難游離，不被著色，故此法能對(duì)DNA進(jìn)行特異性染色。
Feulgen染色后，細(xì)胞核成粉紅色至紫紅色，胞質(zhì)為無(wú)色。
(二)免疫熒光染色法
此法基本原理是將已知抗體或抗原標(biāo)記熒光素，用此特異性試劑，浸染含有相應(yīng)抗原或抗體的組織細(xì)胞標(biāo)本，借助抗原抗體的特異性結(jié)合，于抗原或抗體的存在部位呈現(xiàn)熒光，從而可以定位標(biāo)本內(nèi)的抗原或抗體。
1、主要使用材料
(1)0.01mol/L PBS 稱取NaCl 8g，Na2HPO4. 15g，KH2PO4 0.2g,加蒸餾水至1000mL溶解后，調(diào)pH至7.2。
(2)0.5mol/L硫酸鹽緩沖液(CB) 稱取NaHCO3 3.7g，Na2CO3 0.6g，加蒸餾水至1000mL，溶解后調(diào)pH至9.5。
(3)50%緩沖甘油 1分純甘油加1份CB。
(4)伊文氏藍(lán)溶液 稱取伊文氏藍(lán)1g，加入100mL PBS中，溶解后加1mL 1%NaCO3過(guò)濾；4℃保存。臨用前取0.1mL，加9.9mL PBS稀釋成0.01%濃度使用。
(5)特異性抗體(第一抗體) 熒光素標(biāo)記抗體（第二抗體）。
(6)染色缸、濕盒、振蕩儀、熒光顯微鏡。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備 將7mm×22mm蓋玻片置入培養(yǎng)瓶中，加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，取出蓋玻片，用PBS洗2次；懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞離心后用PBS離心洗滌2次，制成細(xì)胞涂片。
(2)細(xì)胞固定 用醋酸/甲醇或95%酒精固定20～30分鐘。
(3)將固定的細(xì)胞玻片置入蓋片染色缸，用PBS振洗5分鐘，取出吹干。
(4)滴加稀釋的熒光素標(biāo)記抗體(0.01%伊文氏藍(lán)溶液稀釋)，在濕盒中37℃保溫30～60分鐘。
(5)PBS振洗2次，每次5分鐘，然后用蒸餾水振洗1次。
(6)用50%緩沖甘油封片。
標(biāo)本染色后應(yīng)及時(shí)觀察并照相，若暫時(shí)無(wú)時(shí)間觀察則應(yīng)將標(biāo)本放入4℃冰箱保存。但過(guò)夜后特異性熒光會(huì)減弱。如用聚乙稀醇封片，則保存時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。制標(biāo)本和染色時(shí)必須設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照及抑制試驗(yàn)，以排除非特異性染色。要控制顯色反應(yīng)時(shí)間，以陽(yáng)性反應(yīng)著色最強(qiáng)，而有的是剛開(kāi)始著色為佳。滴加抗體的量要適當(dāng)，防止液體干涸。
此種染色法在熒光顯微鏡下觀察，陽(yáng)性部位出現(xiàn)熒光。熒光素種類不同可出現(xiàn)不同顏色的熒光。如異硫氰酸熒光素呈黃綠色熒光，羅丹明B220呈橙紅色熒光。
(三)免疫酶染色法
ABC免疫酶染色法即卵白素—生物素—酶復(fù)合物法，是目前最敏感的免疫細(xì)胞化學(xué)染色法之一。其基本原理是將特異性第一抗體與組織細(xì)胞相應(yīng)抗原結(jié)合后，通過(guò)生物素化橋抗體與第一抗體結(jié)合，借助卵白素與生物素的天然親和性將生物素化辣根過(guò)氧化酶連接為復(fù)合物，通過(guò)酶促反應(yīng)，顯示組織細(xì)胞相應(yīng)的抗原。此法靈敏性高，對(duì)比度佳。
1、使用的主要材料
磷酸鹽緩沖液(0.01mol/L, pH7.4 PBS)；Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L, pH7.6 THB)；底物溶液[臨用前稱取50mg3.3'二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，溶解于100mL THB中，過(guò)濾，然后加20uL 30%H2O2，及時(shí)使用]；ABC試劑盒(美國(guó)VECTOR公司產(chǎn)品，包括正常馬血清、生物素化馬抗小鼠IgG或馬抗兔IgG、卵白素—生物素化辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合酶)；小鼠(兔)特異性抗體；蓋片染色缸、濕盒、顯微鏡等。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備與固定，同免疫熒光染色法.
(2)取已固定的細(xì)胞蓋片,用PBS洗5分鐘,浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 5mL+PBS 200mL) 37℃3分鐘，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。
(3)PBS振洗2次，每次3分鐘。
(4)滴加正常馬血清，在濕盒內(nèi)，37℃保溫30分鐘，以消除非特異性染色。
(5)棄去正常馬血清，滴加小鼠特異性抗體，在濕盒內(nèi)37℃保溫30～60分鐘或4℃下過(guò)夜。
(6)PBS振洗3次,每次3分鐘,滴加生物素化馬抗小鼠IgG，在濕盒內(nèi)37℃30分鐘。
(7)PBS振洗3次，每次3分鐘，滴加ABC復(fù)合劑，在濕盒內(nèi)37℃30分鐘。
(8)PBS振洗2次，THB振洗1次，每次3分鐘，浸入新鮮配制的底物溶液，在室溫下置暗處10～20分鐘。
(9)自來(lái)水洗5分鐘(若采用顯微分光光度計(jì)進(jìn)行定量分折，則無(wú)需作細(xì)胞核襯染，直接進(jìn)行脫水、透明和封片)。
(10)細(xì)胞核襯染 浸入蘇木精染液染色2分鐘，自來(lái)水洗，迅速過(guò)鹽酸酒精溶液，自來(lái)水洗，過(guò)氨水溶液，自來(lái)水洗。
(11)逐級(jí)脫水 過(guò)70%酒精1次，95%酒精2次，無(wú)水乙醇3次，每次1分鐘。
(12)透明，過(guò)二甲苯溶液3次，每次1分鐘。
(13)將有細(xì)胞的面向下，用中性樹(shù)脂封片。
此種染色方法同免疫熒光染色一樣，也應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照和抑制試驗(yàn)?？瞻讓?duì)照用PBS做第一抗體。抑制試驗(yàn)是將待檢標(biāo)本與未標(biāo)記特異性抗體反應(yīng)后，再用自己標(biāo)記的特異性抗體進(jìn)行染色，結(jié)果陽(yáng)性強(qiáng)度減弱或轉(zhuǎn)為陰性。其注意事項(xiàng)同免疫熒光染色法。
此法染色結(jié)果在光鏡下觀察，陽(yáng)性部分呈棕褐色。
(四)細(xì)胞銀染色法
此法用于嗜銀蛋白分析。其基本原理是：核仁形成區(qū)(nucleolar organizer regions NORs)是位于某些近端著絲染色體短臂上含編碼核蛋白體RNA(rRNA)基因rDNA片段的環(huán)狀DNA。這個(gè)區(qū)存在的相關(guān)嗜銀蛋白(Ag NORs)是核仁內(nèi)高度磷酸化，并對(duì)銀有親和作用的酸性非組蛋白，對(duì)rDNA的轉(zhuǎn)錄、rRNA合成、加工和裝配起著重要的作用。AgNORs的含量可反映細(xì)胞增殖活性，其含量越高，表明細(xì)胞增殖越快。用銀染色法能特異顯示細(xì)胞AgNORs，通過(guò)計(jì)數(shù)AgNORs顆粒和測(cè)量AgNORs面積，可定量分析細(xì)胞AgNORs。
1、銀染色法需要的基本材料
50%硝酸銀和1%甲酸(v/v)需用去離子水配制；2%明膠甲酸溶液(稱明膠2g，溶入1%甲酸溶液100mL)；應(yīng)用染色液(在暗室內(nèi)將2%明膠甲酸溶液和5%硝酸銀溶液按1:2的容積比混合)需在染色前新鮮配制；潔凈的蓋片染色缸、吸管、載玻片、鑷子等。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備與固定同前。
(2)固定后的細(xì)胞玻片浸入去離子水中使其水化。
(3)將應(yīng)用染色液滴加于細(xì)胞玻片上，室溫下避光染色1小時(shí)。
(4)用去離子水反復(fù)沖洗，95%～100%系列酒精脫水。
(5)用二甲苯透明。
(6)中性樹(shù)脂封片。
染色液配制一定要用去離子水。注意染色時(shí)間，不同組織標(biāo)本染色時(shí)間不同，其長(zhǎng)短直接關(guān)系到AgNORs顆粒的計(jì)數(shù)結(jié)果，特別要注意。計(jì)數(shù)時(shí)每例樣本不得少于30個(gè)細(xì)胞數(shù)。
染色片在光鏡下可見(jiàn)到細(xì)胞核內(nèi)散著大小不等的黑色顆粒。定量分析可用目鏡形態(tài)定量學(xué)方法和自動(dòng)圖像分析法。前者采用0.5網(wǎng)形目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞核AgNORs顆粒數(shù)，以相互不連的顆粒定為一個(gè)計(jì)數(shù)點(diǎn)。后者采用圖像分析儀自動(dòng)定量分析，先在光鏡下對(duì)待核細(xì)胞定位，通過(guò)攝像系統(tǒng)將細(xì)胞圖像信號(hào)輸入計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)對(duì)每一視場(chǎng)的顆粒個(gè)數(shù)及每一顆粒面積進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別和計(jì)數(shù)。
(五)考馬斯亮藍(lán)(Coomassie, BB)染色法
這是一種顯示細(xì)胞骨架、細(xì)胞內(nèi)微絲的染色方法。
1、需用的材料
固定液[0.1mol/L磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)14.0mL, 0.1N磷酸氫二鈉(NaH2PO4·12H2O)36.0mL，加蒸餾水50.9mL，相混合后再加25%戊二醛50.0mL]；染色液(甲醇46.5mL，冰醋酸7.0mL，加蒸餾水46.5mL，相混合后加考馬斯亮藍(lán)染料0.02g)。
2、染色的基本步驟
(1)細(xì)胞準(zhǔn)備 用支持物蓋片培養(yǎng)法，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70～80%。
(2)將有細(xì)胞的蓋片從培養(yǎng)瓶中取出，投入固定液中固定15分鐘。
(3)先置蒸餾水漂洗2分鐘，再用蒸餾水沖洗兩次，每次1分鐘。
(4)置入考馬斯亮藍(lán)染液中染色60分鐘。
(5)先置蒸餾水漂洗2分鐘，再用蒸餾水沖洗兩次，每次1分鐘。
(6)置入含甲醇冰醋酸液碟皿中(不含染料)，在倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)微絲逐漸明顯，背地清亮?xí)r終止。
(7)按(3)方法漂洗。
(8)用70%～100%酒精逐級(jí)脫水。
(9)用二甲苯透明。
(10)用樹(shù)膠封固。
染色清晰的關(guān)鍵在第(6)步，要特別注意。染色片鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)微絲呈現(xiàn)藍(lán)色。
