細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程

一、 儀器與試劑

二、操作流程：

復(fù)蘇

1) 將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到37℃；

2) 從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞，盡快轉(zhuǎn)入恒溫水浴鍋中復(fù)溫，不斷震蕩凍存管以提高復(fù)溫速率；

3) 將融化了的凍存管中的用移液管轉(zhuǎn)入一直裝有5ml完全培養(yǎng)基的15ml離心管中，充分混勻后，300g離心5min；

4) 離心完成后棄去上清，用1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入T-25細(xì)胞培養(yǎng)中，再加完全培養(yǎng)基4ml，之后轉(zhuǎn)入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。

傳代

1) 將需要那傳代的細(xì)胞從CO₂培養(yǎng)箱中取出，在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，吸棄瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；

2) 向培養(yǎng)內(nèi)加入無菌1×PBS 3ml，之后水平放置培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶，使PBS能夠浸潤到培養(yǎng)平面上所都的面積，吸棄PBS；

3) 重復(fù)步驟2一次，之后向瓶內(nèi)加入消化液2ml，輕微震蕩后放入37℃ CO₂培養(yǎng)箱中孵育1min；

4) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起，如還有部分細(xì)胞未消化下來，可在生物安全柜內(nèi)用移液管吸起消化液，吹打培養(yǎng)平面；

5) 向消化下細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入3ml完全培養(yǎng)基終止消化，然后將培養(yǎng)瓶中的液體轉(zhuǎn)入15ml離心管中，300g離心5min；

6) 離心完成后，棄上清，用2ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將重懸后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入2個(gè)T-25培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶各1ml，提前向每個(gè)培養(yǎng)瓶中各加入4ml完全培養(yǎng)基；

7) 水平放置培養(yǎng)瓶，旋轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分部在培養(yǎng)平面上，然后將培養(yǎng)瓶置于CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

注意：

a) 每次消化不超過2min，如果消化2min后，培養(yǎng)瓶中還有較多細(xì)胞貼壁，可采用分步消化，將消化下來的細(xì)胞移入15mL離心管中和，再向培養(yǎng)瓶中加入胰酶繼續(xù)消化，每次消化不超過2min，直到完全消化下來為止。

b) 細(xì)胞傳代建議1傳2。

凍存

1) 將需要那凍存的細(xì)胞從CO₂培養(yǎng)箱中取出，在生物安全柜內(nèi)，打開培養(yǎng)瓶瓶口，吸棄瓶內(nèi)的培養(yǎng)基；

3) 重復(fù)步驟2一次，之后向瓶內(nèi)加入消化液2ml，輕微震蕩后放入37℃ CO₂培養(yǎng)箱中孵育1min左右；

5) 向消化下細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入3ml含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化，然后將培養(yǎng)瓶中的液體轉(zhuǎn)入15ml離心管中，300g離心5min；

6) 離心完成后，棄上清，用1mL凍存液重懸細(xì)胞沉淀，然后轉(zhuǎn)入1.8ml凍存管中；

7) 將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫；

8) 第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。

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